他克莫司（结构式见图1）是一种强效的大环内酯类免疫抑制剂, 在分子水平，本品的作用是由细胞质内与之结合的蛋白FKBP12介导的。FKBP12使得本品进入细胞内，并形成复合物，该复合物竞争性地与钙调素特异性地结合并抑制钙调素，后者介导T细胞内-钙依赖性抑制性信号传递系统，从而阻止一系列淋巴因子基因转录。体内外实验证明，他克莫是一强效的免疫抑制剂，可抑制细胞毒淋巴细胞的形成，移植排斥反应主要是由后者引起。

他克莫司药抑制T细胞活化及TH细胞依赖性的B细胞增殖，以及淋巴子的生成如白细胞介素2，白细胞介素3及β-干扰素，以及白细胞介素-2受体的表达。他克莫司可抑制皮肤、心脏、肾、肝移植的排斥反应，延长同种移植物的存活时间，已在啮齿类动物、犬、灵长类动物和人类身上得到证实。上市以来已广泛用于肝、肾和骨髓移植的急慢性排斥治疗.

图1:他克莫司结构

一、研发背景

各国药典及注册标准均将他克莫司的杂质控制纳入强制标准体系，其中《美国药典》、《欧洲药典》、《中国药典》等主流药典均对他克莫司的杂质种类、限度及检测方法作出了明确规定，涵盖外观性状、有关物质、含量、储存条件等关键质控项目。不同药典在杂质限度设定、检测方法（如色谱柱选型、流动相组成、检测波长）等方面存在差异，适配不同地区的药品生产与监管要求。本文列举部分他克莫司标准有关物质项下色谱检测参数，如图2所示。

他克莫司杂质作为我司热销杂质系列之一，为了更好的控制他克莫司杂质的品质，我司按照EP标准对他克莫司进行检测。本文针对EP标准检测项下色谱柱的选择进行经验分享。

图2:他克莫司不同标准中色谱检测参数汇总（有关物质项）

图3：他克莫司EP推荐色谱柱

图4：他克莫司EP推荐色谱柱相关信息

但是如果药典中推荐的色谱柱在实验室没有现成的柱子或者基于其他原因需要进行替换。那么如何选择用一根不同品牌或不同系列的色谱柱，来替代方法中规定的原色谱柱呢？

查询相关信息发现：Luna C18(2)为常规通用C18柱，具有超纯硅胶基质、高键合致密度和均匀度，形成的“疏水保护层”惰性强，能有效减少分析物与残留硅醇基团的作用，改善峰形。

基于此，本司选用5种不同品牌C18色谱柱在EP条件下进行对比测试，检测情况如下图6-图9所示：

图5:Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm）

图6:Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）

观察图5及图6，在他克莫司EP标准检测中，使用Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm)及Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）在40 min 附近的基线位置出现了明显的倒峰，这一现象是对定量准确性的直接干扰，将会带来两大风险：

图7：Luna Omega Polar C18 100A (4.6*150mm,5um)

图8：XBridge C18 (4.6*250mm,5μm)

图9：WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)

图11：WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)空白图谱

他克莫司是一种大环内酯类免疫抑制剂，其分子结构中缺乏强共轭的发色团系统，它的主要紫外吸收来自于分子中的羰基(C=O)、羟基(-OH)以及孤立的双键，这些基团的吸收都处于末端吸收区域。因此，他克莫司的最大吸收波长通常在 210 nm 至 220 nm 之间。

对于紫外检测波长在 190 nm ~ 220 nm 之间的区域,通常可以使用低波长专用柱。在低波长的样品检测时，各色谱柱厂商都会推出标注low backgrounds（低背景）或相关表述的色谱柱系列，核心是填料硅胶基质纯化度高、键合相残留低，在紫外低波长下无额外吸收，避免基线漂移/干扰。

本文通过对Zhongpu Science AQ-C18 (4.6*250mm,5μm）、Zorbax SB-C18(4.6*250mm,5μm）、Luna Omega Polar C18 100A (4.6*150mm,5um)、XBridge C18 (4.6*250mm,5μm)及WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)五根色谱柱的选用对比，本次实验结果显示WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)在他克莫司检测中更具优势。因此，如果他克莫司检测中需要进行色谱柱筛选，建议可以优先选择WondaSil C18 Superb (4.6*250mm,5μm)色谱柱进行尝试。